Протеазы (пептид-гидролазы)

Протеолитичеекне ферменты катализируют гидролитическое расщепление белковых веществ до пептидов и гидролиз этих продуктов до аминокислот.

Протеазы делят на две группы: протеиназы и пептидазы. Первые из них расщепляют настоящие белки, а вторые катализируют распад полипептидов и дипептидов до аминокислот. Однако такое деление довольно условно.

При определении активности протеаз в почве в качестве субстрата обычно применяют казеин, желатину и некоторые пептиды. Активность протеаз учитывают по количеству аминокислот или других кислоторастворимых продуктов, освобождающихся при распаде белковых субстратов в почве, либо по изменению физических свойств субстрата, например но уменьшению вязкости.

Колориметрические методы основаны на учете количества аминокислот, образующихся при протеолизе внесенных в почву белков, путем связывания их в окрашенные комплексы.

Метод А.Ш. Галстяна [1978]

Ход анализа. 1 г почвы помещают в стеклянную колбу емкостью 50 мл, прибавляют 5 мл 1-процентного раствора желатины или казеина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,4), и 0,2 мл толуола. Колбу тщательно встряхивают, закрывают корковой пробкой и ставят в термостат на 24 ч при температуре 30 0С, периодически встряхивают. После инкубации добавляют 5 мл воды и содержимое колбы фильтруют. Из фильтрата берут 5 мл раствора в пробирку, прибавляют 0,5 мл 0,1 н. серной кислоты и 3 мл 20-процентного сернокислого натрия для осаждения белков. Затем снова фильтруют в пробирку и добавляют 1 мл 2-процентного раствора нингидрина. Смесь тщательно взбалтывают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Полученный окрашенный раствор из пробирки переливают в мерную колбу объемом 50 мл, объем доводят дистиллированной водой до метки и проводят фотоколориметрирование, используя зеленый светофильтр (длина волны 500-560 нм). Контрольные пробы ставят со стерилизованной сухим жаром почвой и субстратом без почвы. Количество аминокислот в переводе на глицин находят по калибровочной шкале, составленной на чистый глицин.

Активность протеазы выражают в миллиграммах глицина на 1 г почвы за 24 ч.

Реактивы:

1) 1-процентный раствор желатины или казеина в фосфатном буфере (рН 7,4) - при биодиагностике используют водный раствор;

2) толуол;

3) фосфатный буфер (рН 7,4);

4) 0,1 н. Н2SO4;

8) 2-процентный раствор нингидрина: 2 г нингидрина растворяют в 100 мл ацетона. Рабочий раствор готовят, смешивая 95 мл ацетонового раствора с 1 мл СН3СООН и 4 мл воды. Поскольку раствор нестойкий, готовят его только перед употреблением;

7) стандартный раствор глицина: водный раствор глицина концентрации 100 мкг в 1 мл. Путем соответствующих разбавлений готовят рабочие растворы, окрашивают нингидрином (как описано выше) и составляют шкалу.

Интересное из раздела

Загрязняющие вещества атмосферного воздуха и их влияние на морфофизиологические показатели растений
Атмосферный воздух такого состава, к которому мы привыкли, сформировался еще 200 миллионов лет назад. На протяжении многих веков он оставался неизменным. Именно при таких соотношениях воздух ...

Совершенствование деятельности администрации муниципального образования Город Хабаровск
Актуальность темы. Развитие зеленой экономики стало фактом уже много лет назад. Однако до сих принципы ее остаются по большей части не восприняты. Логика развития человечества в целом, р ...

Аттестация рабочего места электрогазосварщика
Аттестация рабочих мест по условиям труда — оценка условий труда на рабочих местах для выявления вредных и (или) опасных производственных факторов (ст. 209 ТКРФ). Аттестация рабочих мест ...