Уреаза (карбамид-амидогидролаза)

Уреаза гидролизует карбамид (мочевину) до аммиака и углекислого газа:

уреаза

NH2—С—NH2 + Н20 2 NH3 + CO2

║

О

В почве мочевина (карбамид) образуется в процессе превращения азотистых органических соединений - белков и нуклеиновых кислот. В значительном количестве карбамид вносится с навозом и в форме концентрированного азотного удобрения. Образовавшийся в результате уреазной реакции аммиак служит непосредственным источником азотного питания растений. Поэтому активность уреазы является одним из важнейших показателей биологической активности почв. Методы определения активности уреазы почвы основаны на учете количества аммиака, образующегося при гидролизе карбамида.

Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы помещают в колбы на 50 мл, добавляют 5 мл 3-процентной мочевины и 1-2 капли толуола. Контролем служат стерилизованная почва (180 °С, 3 ч) и субстраты без почвы. Колбы закрывают корковыми пробками, встряхивают и ставят в термостат при 80 0С на 24 ч. В течение инкубации колбы периодически встряхивают. По окончании инкубации в колбу добавляют 15 мл 1,0 н. раствора KCl и встряхивают в течение 5 мин для вытеснения из почвы аммиака. Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 5-10 мин при 3000 об./мин или фильтруют через складчатый беззольный фильтр. Берут пипеткой 2-10 мл фильтрата (в зависимости от содержания аммиака, в черноземах - 2 мл) в мерную колбу на 50 мл, дистиллированной водой доводят объем до 30 мл, перемешивают. Прибавляют из бюретки 2 мл 30-процентного раствора калия-натрия виннокислого, перемешивают. Прибавляют из бюретки 2 мл реактива Несслера, перемешивают, доводят водой до метки, перемешивают. Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах шириной 30 мм с синим светофильтром (длина волны 400 нм).

Количество аммиака рассчитывают до предварительно составленной калибровочной кривой. Стандартный раствор: 0,1 мг NH3 в 1 мл воды.

Примечание. Дистиллированную воду необходимо проверять на содержание аммиака. Контроль - предварительно стерилизованная сухим жаром почва при 180 0С в течение 3 ч.

Активность уреазы выражается в миллиграммах NН3 на 10 г почвы в сутки:

NН3 = (а - б) · p · 10 / н, где

а - количество аммиака по графику, мг;

б - количество аммиака в контроле по графику, мг;

р - разведение;

н - навеска воздушно-сухой почвы, г.

Реактивы:

1) 3-процентный раствор мочевины;

2) 1 н. раствор КСl (74,5 г хлористого калия растворить в дистиллированной воде и довести до 1 л);

3) 30-процептный раствор сегнетовой соли;

4) реактив Несслера;

5) стандартный раствор NH4Cl в концентрации 0,005 мг N—NH3, в 1 мл.

Интересное из раздела

Последствия Чернобыльской аварии
Черно́быльская ава́рия — разрушение 26 апреля 1986 года четвёртого энергоблока Чернобыльской атомной электростанции, расположенной на территории Украины (в то время — Украинской СС ...

Аттестация рабочего места электрогазосварщика
Аттестация рабочих мест по условиям труда — оценка условий труда на рабочих местах для выявления вредных и (или) опасных производственных факторов (ст. 209 ТКРФ). Аттестация рабочих мест ...

Платность за пользования природными ресурсами
Природопользование как сфера знания включает в себя элементы естественных, общественных и технических наук (в том числе охрану природы с ее разделами - охраной атмосферы, вод, ресурсоведени ...